10基于构象敏感毛细管电泳的异源双链分析

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基于构象敏感毛细管电泳的异源双链分析

异源双链分析(HDA)是一种简便且经济高效的技术,可快速筛选突变。 通过PCR扩增目基因的DNA,然后进行变性步骤。复性后,杂合突变DNA或混合的野生型和突变DNA形成异源双链体。与相应的同源双链DNA相比,该异源双链DNA具有不同的电泳迁移行为。

被称为构象敏感性毛细管电泳(CSCE)的异源双链分析原理经过改进,已成为Applied Biosystems公司自动毛细管遗传分析仪上使用的灵敏高通量突变筛选技术(应用说明106IN02-01,2005年5月)。这些仪器的自动化程度和通量以及所获得数据的准确性,使得可以可靠地测试大量样品的突变,从而可以减少测序工作量,从而确定潜在的突变体。事实证明,CSCE对于遗传性疾病和癌症的筛查具有不可估量的价值,并为人类遗传学植物育种细菌学等许多其他应用提供了巨大潜力。

在典型的CSCE实验设置中,许多靶基因被扩增形成一个片段(面板)。在最简单的设置中,可以合并在一起的PCR产物(靶标)的数量取决于所用彩色染料的数量。但是,如果可以设计出长度明显不同的PCR产物,则可以使用相同的染料将这些产物汇集在一起。下图显示了一个典型的设置,其中精心选择了8个靶标(PCR产物),以便每次短片段和长片段都可以用相同的染料标记并在同一样品池中混合。

Pooling strategy

BioNumerics中的异源双链分析

通过与Applied Biosystems公司以及英国和荷兰的三个参考测试实验室的合作,Applied Maths公司为BioNumerics中基于CSCE的自动化高通量HAD开发了一个高度专业化的插件。 BioNumerics HDA插件支持使用不同长度范围的组合PCR产品(请参见上面的示例),并具有内置的警告系统以防止范围之间可能重叠。

BioNumerics提供了一个完全自动化的工作流程从导入原始跟踪文件到为每个扩增子分配野生型或突变型。工作流程中的所有结果问题或警告都将在任务预览体现,并且只需单击一下鼠标即可查看详细信息。

导入跟踪文件

File name parsing

命名方式是文件自动化导入的重要部分。当使用一致的名称格式时,BioNumerics可以从跟踪文件名中解析目标和库信息,但它也可以从跟踪文件中提供的Sample和Comment字段中读取信息。定义池和命名方式后,只需单击几下即可自动批量导入跟踪文件。尽管一批文件通常由同一批运行的跟踪文件组成,但该软件允许导入和处理来自不同批次运行的跟踪文件

寻找正确的目标峰

Target PCR

BioNumerics HDA软件不需要在每个跟踪信号中都包括内部尺寸标准,因此所有可用的染料都可用于样品数据。 取而代之的是,使用预期位置,信号宽度以及左右控制范围在跟踪信号的定义区域内搜索目标峰,所有这些都可以为每个目标单独指定。即使在使用相同的染料混合不同长度的PCR产物的设置中,只要正确设置参数,也始终可以实现正确的靶标识别。

自动峰匹配

可靠的峰匹配是CSCE分析中最关键的步骤。 Applied Maths利用图形匹配方面的专业知识开发了一种快速灵敏和可靠的峰匹配工具,该工具甚至可以检测到最小的峰形偏差。对于每种靶PCR产物,可以定义一个或多个靶变体。例如,可以创建一种野生型,用户可以为其定义一个或多个代表性峰。另外,可以创建多态变体,也可以为其分配一个或多个代表性峰。

自动峰匹配的结果显示在易于理解的预览窗口中。 参考峰匹配、错配、错误峰和潜在问题均通过文字和直观的颜色清楚地示。

HDA curves

存在许多简单的快捷键和按钮或菜单选项,用于放大或缩小、生成详细的峰与峰比、,编辑目标信息、根据相似性排列峰等。

HDA match result尽管可以使用正确的参数设置将自动匹配算法调整为非常灵敏和准确,但是可以轻松地针对任何单个峰校正匹配结果。用户可以将匹配的峰更改为配的峰,或将配的峰更改为野生型或多态变体。用户修改的峰用不同的颜色表示。注释字段可用于描述特定峰或对其进行的更改内容

由于正确匹配参数的评估对于自动模式匹配的成功至关重要,因此该软件提供了特殊的工具,可以根据一组已知的突变和非突变样本自动计算最佳匹配参数。 因此,可以基于批量导入的已知样本来校准参数集。

数据库和报告

通过BioNumerics软件的全面而强大的数据库工具,CSCE样本可以通过大量信息字段附件图片HTML链接文档等进行描述和记录,并可以在经过认证的环境中使用。最重要的是,BioNumerics提供了强大的查询和数据库查看工具,因此即使包含数千个样本的大型数据库也可以轻松进行管理。

批次中的所有样品,或数据库中任何选择样品都可以在报告窗口中放在一起,在方便排列的预览中显示匹配结果以及所选样品数据。用户也可以在此窗口中编辑峰,并且只需单击鼠标或键即可显示详细的峰比较。

HDA report

        由于插件的安装需要许可证认证,如需请联系我们获取。

   







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2020年6月22日 17:18
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